IGF-1 LR3 Liyofilize,The freeze-dried long-acting insulin-like growth factor-1 LR3 formulation uses low-temperature vacuum drying technology to remove moisture, preventing peptide degradation or aggregation in liquid formulations and extending the shelf life (usually up to 2 years at -20 ℃). It can be directly used after reconstitution, reducing transportation and storage costs. At the same time, the freeze-drying process can remove impurities and improve the purity of the formulation (usually>%95). Ancak uzun-süreli kullanım reseptör duyarsızlaşmasına neden olabilir ve aralıklı uygulama gerektirebilir. Yüksek dozlar hipoglisemiye neden olabilir ve kan şekeri düzeylerinin izlenmesi gerekir.
Sadece saf toz ve kapsüller değil, aynı zamanda diğer dozaj formlarını da sağlıyoruz. Gerekirse lütfen satış ekibimizle iletişime geçin.
Ürünlerimiz
IGF-1 LR3 COA
Gen klonlama ve ifade vektörü yapımı
Gen tasarımıIGF-1 LR3 Liyofilizedoğal IGF-1 dizisine dayanmaktadır, ancak aşağıdaki temel modifikasyonlara sahiptir:
N-terminal uzantısı: Yarı ömrünü uzatmak ve biyolojik aktivitesini arttırmak için IGF-1'in N-terminaline 13 amino asit (MFPAMPLSSLFFN) ekleyin.
Amino asit ikamesi: IGFBP ile bağlanma kabiliyetini azaltmak ve serbest konsantrasyonu arttırmak için IGF-1'in 3 pozisyonundaki glutamik asidi (Glu) arginin (Arg) ile değiştirin, yani R3 modifikasyonu.
gen sentezi
Hedef gen parçasını, tasarlanan IGF-1 LR3 gen dizisine dayalı olarak kimyasal sentez veya PCR amplifikasyonu yoluyla elde edin. Kimyasal sentez genellikle katı faz sentez teknolojisini benimser, yavaş yavaş nükleotidler eklenir ve son olarak tam gen fragmanları sentezlenir. PCR amplifikasyonu, primerleri tasarlamak ve hedef geni PCR reaksiyonu yoluyla amplifiye etmek için bilinen IGF-1 dizilerini kullanır.
Uygun ekspresyon vektörünün seçilmesi, protein ekspresyonunda çok önemli bir adımdır. Yaygın olarak kullanılan ekspresyon vektörleri arasında pET serileri (pET30a gibi), pGEX serileri vb. bulunur. Bu vektörler, daha sonraki protein saflaştırmasını ve tespitini kolaylaştıran etkili promotörlere, çoklu klonlama bölgelerine ve etiket dizilerine (His etiketleri gibi) sahiptir.
Örneğin, pET30a ifade vektörünün yapım adımları aşağıdaki gibidir:
Enzimatik bölünme: BamHI ve XhoI gibi kısıtlama endonükleazlarını kullanarak pET32a vektörü ve IGF-1 LR3 gen fragmanı üzerinde çift enzim bölünmesi gerçekleştirerek tamamlayıcı yapışkan uçlar üretin.
Bağlantı: Enzimle sindirilen vektör ve gen fragmanı, rekombinant ekspresyon vektörü pET32a-LR3-IGF1'i oluşturmak için T4 DNA ligaz ile bağlanır.
Transformasyon: Rekombinant ekspresyon vektörünü yetkin E. coli hücrelerine (DH5 gibi) dönüştürün ve antibiyotik taraması (ampisilin gibi) yoluyla pozitif klonlar elde edin.
Tanımlama: Koloni PCR, enzim sindirimi tanımlama veya sıralama gibi yöntemlerle rekombinant ekspresyon vektörünün doğruluğunu doğrulayın.
Protein ifadesi
İfade suşlarının seçimi
Uygun ekspresyon suşunun seçilmesi protein ekspresyonu için çok önemlidir. Yaygın olarak kullanılan ekspresyon suşları arasında Rosetta (DE3), BL21 (DE3), vb. yer alır. Bu suşlar, etkili T7 RNA polimeraz sistemlerine sahiptir ve T7 promotörü tarafından tahrik edilen genleri verimli bir şekilde eksprese edebilir.
Örnek olarak Rosetta'yı (DE3) ele alırsak, özellikleri şunları içerir: IPTG ekspresyonu tarafından indüklenen T7 RNA polimeraz genini içerir. Nadir kodon tRNA genlerinin taşınması, nadir kodonlar içeren eksojen genleri verimli bir şekilde eksprese edebilir. Toksik proteinlerin ekspresyonuna veya ekspresyonu zor proteinlerin ekspresyonuna uygundur.
İfade koşullarının optimizasyonu
İndükleyici konsantrasyonu, indüksiyon sıcaklığı, indüksiyon süresi vb. gibi protein ekspresyon koşulları, protein verimi ve kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Ekspresyon koşullarının optimize edilmesiyle IGF-1 LR3'ün ekspresyon seviyesi arttırılabilir.
İndükleyici ajan konsantrasyonu: IPTG, konsantrasyonu tipik olarak 0,1-1 mM arasında olan, yaygın olarak kullanılan bir indükleyici ajandır. En yüksek protein ekspresyon seviyesini elde etmek için gradyan deneyleri yoluyla optimum IPTG konsantrasyonunu belirleyin.
İndüksiyon sıcaklığı: İndüksiyon sıcaklığı genellikle 16-37 derece arasında seçilir. Daha düşük sıcaklıklar (16-20 derece gibi) protein bozunmasını ve inklüzyon cisimciği oluşumunu azaltmaya ve çözünür proteinlerin verimini artırmaya yardımcı olabilir.
İndüksiyon süresi: İndüksiyon süresi genellikle 2-24 saat arasındadır ve optimal indüksiyon süresi, zamanlı örnekleme yoluyla protein ekspresyon seviyelerinin analiz edilmesiyle belirlenir.
Protein ifadesi tespiti
İfadesiIGF-1 LR3 LiyofilizeSDS-PAGE ve Western blot yöntemleriyle tespit edildi.
SDS-PAGE: İndüksiyondan önce ve sonra bakteriyel numuneleri toplayın, ultrasonik parçalama veya kimyasal lizis gerçekleştirin, süpernatantı ayırmak ve çökeltmek için santrifüjleyin ve SDS-PAGE analizini ayrı olarak gerçekleştirin. İndüksiyondan önce ve sonra süpernatan ve çökeltideki protein bantlarındaki değişiklikleri karşılaştırarak IGF-1 LR3'ün ekspresyonu doğrulandı.
Western blot: IGF-1 LR3'ün ekspresyonunu ve moleküler ağırlığını daha da doğrulamak amacıyla SDS-PAGE ile ayrılmış proteinler üzerinde immünoblot analizi gerçekleştirmek için spesifik antikorlar (anti His etiketi antikorları veya anti IGF-1 antikorları gibi) kullanın.
Protein Saflaştırma
Bakteriyel lizis
İndüklenen bakteri hücrelerini toplayın ve hücre içi proteinleri serbest bırakacak şekilde parçalayın. Yaygın kırma yöntemleri arasında ultrasonik parçalama, yüksek-basınçlı homojenleştirme, kimyasal parçalama vb. yer alır. Ultrasonik parçalamayı örnek olarak alırsak, adımlar aşağıdaki gibidir:
Bakteriyel toplama: Bakteri hücrelerini toplamak için indüklenen ekspresyon bakteriyel çözeltisini santrifüj edin ve bunları lizis tamponunda (PBS veya Tris HCl tamponu gibi) yeniden süspanse edin.
Ultrasonik parçalama: Bakteriyel süspansiyon bir buz banyosuna yerleştirilir ve aşırı ısınma nedeniyle protein denatürasyonunu önlemek için genellikle kısa-dönemli çoklu parçalama yöntemi (her seferinde 10 saniye, 10 saniye aralıklarla, 10 kez tekrarlanan gibi) kullanılarak ultrasonik bir parçalayıcı kullanılarak ezilir.
Santrifüjlü ayırma: Süpernatantı ayırmak ve çökeltmek için ezilmiş bakteri süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatan, çözünebilir proteinler içerirken, çökelti, inklüzyon cisimcikleri veya hücre artıkları içerebilir.
Afinite kromatografisi
Rekombinant IGF-1 LR3'ün tipik olarak bir His etiketi taşıması nedeniyle nikel iyon afinite kromatografisi (Ni NTA) kullanılarak saflaştırılabilir.
Sütun hazırlığı: Ni NTA ambalajını kromatografi sütununa yükleyin ve dengeleme tamponu (20 mM imidazol içeren PBS gibi) ile dengeleyin.
Örnek yükleme: Bakteriyel lizatın süpernatanını kromatografi kolonuna yükleyin ve His etiketli IGF-1 LR3'ün nikel iyonlarıyla bağlanmasına izin verin.
Yıkama: Bağlanmamış veya zayıf bağlı safsızlık proteinlerini çıkarmak için kromatografi kolonunu yıkama tamponu (50 mM imidazol içeren PBS gibi) ile yıkayın.
Elüsyon: Kromatografi kolonuna bağlı IGF-1 LR3'ü elüsyonlamak için elüsyon tamponu (250 mM imidazol içeren PBS gibi) kullanın ve elüenti toplayın.
Tuzdan Arındırma ve Konsantrasyon
Elüsyondan sonraki IGF-1 LR3 çözeltisi, protein konsantrasyonunu arttırmak için tuzdan arındırma ve konsantrasyon adımları yoluyla çıkarılması gereken yüksek konsantrasyonda imidazol içerir.
Tuzdan arındırma: İmidazolü elüentten çıkarmak için bir tuzdan arındırma kolonu veya diyaliz torbası kullanın ve bunu uygun bir tampon solüsyonla (PBS gibi) değiştirin.
Konsantrasyon: Protein konsantrasyonunu istenen seviyeye artırmak için ultrafiltrasyon tüpleri veya santrifüj yoğunlaştırıcılar kullanarak tuzdan arındırılmış protein çözeltisini konsantre edin.
Saflık ve aktivite testi
Saflaştırılmış IGF-1 LR3'ün saflığı ve aktivitesi SDS-PAGE, HPLC veya ELISA yöntemleriyle tespit edildi.
SDS-PAGE: Saflaştırılmış proteinin saflığını analiz edin ve belirgin bir safsızlık bandının olmadığını doğrulayın.
HPLC: Proteinlerin saflığını ve moleküler ağırlık dağılımını daha fazla analiz etmek için ters fazlı HPLC veya boyut dışlamalı HPLC kullanın.
ELISA: Enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA), IGF-1 LR3'ün biyolojik aktivitesini tespit etmek için kullanılır ve aktivite seviyesi, spesifik antikorlara bağlanma derecesine göre yansıtılır.
Dondurarak kurutma işlemi
Dondurarak kurutma prensibi
Liyofilizasyon, düşük-sıcaklıkta dondurma ve vakumlu süblimleştirme yoluyla nemi gideren bir kurutma tekniğidir. Dondurarak-kurutma işlemi üç aşamayı içerir: proteinin aktivitesini ve stabilitesini en üst düzeye çıkarabilen ön dondurma, süblimasyon kurutma ve desorpsiyon kurutma.
Dondurarak kurutma adımları
Saflaştırılmış IGF-1 LR3 çözeltisini dondurarak kurutma şişelerine veya penisilin şişelerine bölün ve çözeltiyi tamamen dondurmak için bunları -40 derecenin altında önceden dondurmak üzere bir dondurarak kurutucuya yerleştirin.
Vakum koşulları altında sıcaklığı kademeli olarak yaklaşık -20 dereceye yükseltin, buzun doğrudan su buharına süblimleşmesine ve nemin çoğunu çıkarmasına izin verin. Bu aşamada protein denatürasyonunu veya çökmesini önlemek için ısıtma hızının ve vakum derecesinin kontrol edilmesi gerekir.
Kalan nemi gidermek ve dondurularak kurutulmuş ürünün nem içeriğini %1'in altına düşürmek için sıcaklığı 20-30 dereceye daha yükseltin. Bu aşamada nemin tamamen giderilmesini sağlamak için yüksek derecede vakum sağlamak gerekir.
Kurutma tamamlandıktan sonra, nemin yeniden girmesini önlemek için dondurarak-kurutma şişesini veya penisilin şişesini hızla kapatın.
Dondurarak kurutma koruyucusu
Dondurarak-kurutma sırasında IGF-1 LR3'ün aktivitesini ve stabilitesini korumak için genellikle dondurarak-kurutma koruyucularının eklenmesi gerekir. Yaygın dondurarak kurutma koruyucuları şunları içerir:
- Karbonhidratlar: aljinat, sükroz, glikoz vb. camsı yapılar oluşturabilir ve protein konformasyonunu stabilize edebilir.
- Polietilen glikol (PEG) ve polivinilpirolidon (PVP) gibi polimerler çözeltilerin viskozitesini artırabilir ve protein toplanmasını azaltabilir.
- Glisin ve alanin gibi amino asitler, proteinlerin yapısını stabilize ederek hidrojen bağı donörleri veya alıcıları olarak hareket edebilir.
- Tween 20, Tween 80 vb. gibi yüzey aktif maddeler, proteinlerin kap duvarlarına adsorpsiyonunu azaltabilir ve geri kazanım oranlarını iyileştirebilir.
Örnek olarak trehaloz alınırsa, ilave miktarı genellikle protein kütlesinin 1-10 katıdır ve bu, dondurarak kurutma sırasında protein denatürasyonunu önlemek için koruyucu bir tabaka oluşturabilir.
Dondurarak Kurutma Prosesinin Optimizasyonu
Dondurarak-kurutma işleminin optimizasyonu, ürünün kalitesinin artırılması açısından çok önemlidir.IGF-1 LR3 Liyofilize. Ön dondurma sıcaklığı, süblimasyon kurutma sıcaklığı, analitik kurutma sıcaklığı ve vakum derecesi gibi parametreleri ayarlayarak en iyi dondurarak-kurutma etkisi elde edilebilir.
Donma öncesi sıcaklık
Çözeltinin tamamen donmasını sağlamak için ön dondurma sıcaklığı proteinin ötektik noktasından düşük olmalıdır. Genellikle -40 derecenin altındaki sıcaklıklar seçilir.
Süblimasyon kurutma sıcaklığı
Süblimasyon kurutma sıcaklığı, protein denatürasyonunu veya kabın çökmesini önlemek için proteinin çökme sıcaklığından daha düşük olmalıdır. Genellikle -20 derece civarı seçilir.
Analiz kurutma sıcaklığı
Analiz kurutma sıcaklığı, kalan nemi uzaklaştırmak için süblimasyon kurutma sıcaklığından daha yüksek olmalıdır. Genellikle 20-30 derece seçilir.
Vakum derecesi
Vakum derecesi düşük bir seviyede tutulmalıdır (örn.<100 mTorr) to promote the sublimation and removal of moisture.
Popüler Etiketler: igf-1 lr3 liyofilize, Çin igf-1 lr3 liyofilize üreticiler, tedarikçiler, CJC 1295 Krem, CJC 1295 Sprey, IGF 1 LR3 Kapsülü, IGF 1 LR3 Enjeksiyonu, MT2 Tozu, peptitler sağlıklı
